(一)试剂准备
HEPES
透明质酸酶
PVP
青霉素G
Pereoll
EBSS．10x
(二)试剂的配制
1．HEPES—BUFFER EBSS溶液的配制
丙酮酸钠 3mmol／L
青霉素G 100000U／L
硫酸链霉素 56 248U／L
HEPES 2lmmol／L
碳酸氢钠4ramol／L
EBSS(10x)
H20(组织培养级)
称取5．96Hepes~H20hh，用0．2mol／LNaOH调pH至7．35-7．4，过滤，放4℃冰箱内保存。
250mL HES工作液的配制
丙酮酸钠0．00825g
青霉素G 25 000U
硫酸链霉素 14 062U
碳酸氢钠0．0843g
250mL HEPES贮存液 21mL
EBSS(10x) 25mL
H20(组织培养级) 204mL
溶解混匀，测渗透压，280～285mOsm／kg，0．2pm滤膜过滤，4cC保存。
2．15％sHES溶液的配制
取5 mL培养管，加0．6 mL过滤的母体血清，加3．4 mL HES，使用前混匀，加温至37℃。
3．pliES(5％)
当母体血清因故不能使用，可使用5％PPF，PPF的终浓度为0．35％。取5 mL置培养管，取0．28 mL Plasmanate加到3．62 mL HES中，使用前混匀，37℃中保温。
4．透明质酸酶溶液
在进行ICSI之前，用透明质酸酶溶液(1 mg／mL)溶解卵细胞周围的颗粒细胞和放射冠，透明质酸酶30 mg／瓶，冻干无菌，用3 mL无菌HES稀释透明质酸酶30 mg／瓶；取0．1 mL加入到1．2 mL冷冻管中，每管含透明质酸酶1 mg，使用前置一20cC冰箱中保存，当裸露卵细胞时，从一20℃冰箱中取出l管，放置室温内，加0．9 mL sHES或pliES，混匀，过滤消毒(0．22um过滤器)置37℃，透明质酸酶终浓度为1 mg／mL。
5．pliES
用途：附睾精子抽吸和睾丸精子抽吸使用。
HES 27．3mL
Plasmanate(5％PPF) 2．1mL
肝素5 000U／mL 0．6mL
上述3种溶液放人50 mL组织培养瓶中，混匀，置4℃保存，使用前，从4℃冰箱中取出，放置室温下。
6．5％PVP
配制方法：
(1)制备4％HSA，取5mL HES溶解0．2g HSA。
(2)称取0．1 PVP加2mL含4％HSA的HES，放置数小时待PVP完全溶解。
(3)取5％PVP溶液1．5mL eppendorf离心管离心，13 000 r／min，共5 min。
(4)取上清液，经O．21am滤膜滤过，冷冻管4℃保存。
(5)PVP溶液配制后，保存期不可超过一个月。
7．非连续Percoll梯度离心液
用途：制备精子。
配制方法：
(1)供配制Percoll(10x)的EBSS
丙酬酸钠 0．0165g
青霉素G 50 000U
硫酸链霉素 28 125U
HSA 1．75g
混匀，0．2pro滤膜过滤。
(2)供配制Percoll(1×)的EBSS
配制Percoll—EBSS(10x) 5mL
碳酸氢钠0．11g
组织培养级H20 45mL
混匀，0．2pro滤膜过滤。
(3)制备90％Percoll梯度
Percoll—EBSS(10x)4．5mL
Percoll 40．5mL
充分混匀，置4~C冰箱内。
(4)制备70％Percoll梯度
EBSS for Percoll(1×) 5．7mL
90％Percoll梯度 20．0mL
充分混匀，置4℃冰箱内保存。
(5)制备45％Percoll梯度
EBSSfr)rPercoll(1×) 15mL
90％Percoll梯度 15mL
充分混匀，置4℃冰箱内保存。
8．矿物油
用途：使用0．35％PPF／EBSS(pEBSS)平衡矿物油覆盖C02温箱卵细胞培养微滴。
配制方法：50 mL培养瓶中，先加10 mL pEBSS，后加40 mL矿物油于pEBSS之上，用铝铂纸包裹，在室温内保存，使用时超过2周重新配制。
pPBS平衡矿物油
在ICSI过程中，用0．35％PPF／EBSS平衡矿物油覆盖培养微滴。
配制方法：50 mL培养瓶，放0．7mL 5％PPF，然后加入9．3mL PBS，混匀，再将40mL矿物油放置pPBS顶部，用铝铂纸包裹，保存在室温内，不超过2周。
供洗卵用fEBSS
每周新鲜配制250 mL fEBSS。
每250 mL fEBSS含：
丙酮酸钠 0．002 85g
青霉素C 25 000U
硫酸链霉素 14 062U
碳酸氢钠 0．29g
EBSS(10x) 25mL
加组织培养级H20至250 mL，0．2 pm滤膜过滤，保存在4℃冰箱。
pEBSS的配制方法：
终体积Plasmanate EBSS
50mL 3．5mL 46．5mL
20mL 1．4mL 18．6mL
l 0mL 0．7mL 9．3mL
sEBSS的配制方法
终体积 母体血清 EBSS
50mL 7．5mL 42．5mL
20mL 3．0mL 17．0mL
(三)精液准备
排出的精液待液化后移入无菌离心试管中，Earle’s培养液冲洗，1 800g离心5 min，去上清。根据精子的密度和活力进行进一步处理，如果精子悬液中的浓度高于2×106／mL，则稀释到1～2×106／mL之间，经Percoll梯度处理后精子密度仍低，可将精子悬液再行离心，1 800 gX5 min，去上清，留下5～10ul混悬液，保证显微注射的液滴中有足够的精子。{生殖就医指南网ww w.９１zn.cn.是你知心的朋友} 精子悬液经5％02、5％C02和90％Nz混合气体处理后，密封试管，置37℃温箱内，待到进行微注射时取出。
精子除了来自于体外排精外，还可以通过显微外科手术获取附睾中的精子和新鲜人体睾丸组织的精子。此外还可用精母细胞进行显微授精。
(四)卵子的准备
将经5％c02培养箱堵养4 h的卵子吸入透明质酸酶溶液的培养皿中，用吸管反复冲洗印子，直至完全除去卵子外层的颗粒细胞，防止阻碍注射针的进入或难以分辨卵浆及精子。将卵子置于倒置显微镜下进行质量及成熟度的评估，确定第一极体是否存在，将选择好的卵子转移到含10％HTF中，供ICSI用。
(五)IcsI操作
在倒置显微镜的恒温载物台上，安装好持卯针和穿刺针，调节显微镜注射装置，使其可灵活地控制吸收精子，在低倍显微镜下依次调节持卵针和穿刺针的角度和位置，两个针头相对并与载物台平行。
从Petri皿中央微滴中选择单个形态正常的精子，将吸有少量PVP的穿刺针在精子的尾部1／3处摩擦精子，使精子制动，或在其尾部中段迅速制动，然后将精子吸回穿刺针，吸时尾部在先。移动Petri皿，以便在液滴中发现印子，用持卵针轻轻拨动卵子，使其第一极体位于6点或12点处，避免损伤纺锤体。持卵针轻微负压吸住卵子，穿刺针在3点的位置上推进，穿过透明带和卯膜，进入卵母细胞浆内，缓慢将精子注入卵细胞内，应尽量减少进入卵母细胞中的PvP液。轻轻退出穿刺针，退针时，将持卵针保持原固定位置，然后松开持卵针。大多数情况下，裂孔边缘呈漏斗状，指向卵细胞内，提示卵子的质量较好。
然后重复上述选精及注射的过程直至所有被选中的细胞分裂Ⅱ期的卵子均被注射完毕。将所有注射过的卵子在含10％血清的HTF中冲洗数次，再移入另一含10％血清的HTF中Petri皿内继续培养。
