一个精子穿入一个卵子的细胞质形成受精卵，这个受精卵叫合子(zygote)。受精卵虽然是由一个精子和一个卵子结合形成，但生育年龄的男性在一次正常的交合后，生育年龄的女性的一个卵子需要和射出的精液中难以记数的精子在输卵管相遇才能完成受精过程。仅一个精子和一个正常的卵子成功地自然受精几乎是不可能的事。胚胎学家尝试注射哺乳动物的精子进入卵子受精的研究已达数十年之久，这为人的精子注射成功奠定了一定的基础。1992年，比利时布鲁塞尔大学的几位科研人员，在“手术刀”杂志发表了．他们轰动一时的文章，他们在文章中宣布，在显微镜下将人的一个精子直接注射到一个卵子中，然后将其重新放回妇女的子宫并受孕成功。由此，ICSI(intracytoplasmic：sperm injection)被公认为是当今治疗男性不育的非常有价值的方法。自从1992年以来，世界上已诞生了数万计的ICSI婴儿。中国各大城市的IVF(in vitro fertilization)中心也已普遍应用此项技术。

    一、ICSI的适应证

    常规IVF要求精液中的含精量不能低于5×106／ml，运动力强和形态正常的精子大约要在30％以上。任何因为精子数量和质量上不合乎做常规IvF者，都可实施ICSI手术治疗。男女双方术前检查各项指标基本正常而又多年不能自然怀孕者，可用豚鼠卵做精子穿透实验，此项穿透实验阴性者越过常规IVF直接选择做ICSI手术。对那些男性每次射出的精液中精子数量很多(甚至有上亿精子)，但因为精子功能问题无法完成受精过程也应该选择做ICSI手术。

    根据精子的来源，ICSI可分为常规ICSI、附睾穿刺取精ICSI及睾丸活检ICSI。如果睾丸活检实验也找不到精子而有精圆细胞，可考虑做ROsI(round sperm iniection)。可以说，ICSI手术基本上解决了男性不育的问题。但究竟什么样的遗传性疾病男性病人不宜做ICSI手术(除去医疗费用的因素外)，是社会伦理讨论的课题。

    二、常规IcSI

      (一)手术前一天的准备工作

    手术前一天要准备ICSI注射皿、清洗皿和培养皿，并预热10ml HTF‘培养液全部置于37℃，5％CO，的培养液中过夜。

    1．ICSI注射皿ICSI注射皿使用100×15film培养皿的盖子(F'alconl029)，中间滴放50ml PVP(IRvINE SCIETIFIC等公司生产)，周围可放4～6滴50ml HTF+10％SSS的培养液，上覆盖矿物油(也可向公司订购特制的ICSI皿)。

    2．清洗皿  准备两个Organ培养皿(Falton3037)，Organ培养皿是一种中间凹周围有槽围绕的专门为培养卵子设计的培养皿，中间放满HTF+10％SSS的培养液，周围槽中仅放HTF培养液供初步清洗和保持湿度之用。

    3．培养皿用小的Falcon培养皿，内放数个培养液滴，每滴约50ral HrrF+10％SSS的培养液，上面覆盖矿物油。

    清除卵丘细胞的玻璃细针管可在手术前一天或当天早晨用消毒的巴斯德玻璃管在酒精灯上拉制，拉成大约150bUm和120Um两种口径的细针管备用(可向Diagnostics，inc订购从100~tm到270fUm不同口径的巴斯德玻璃管，产品号码STRIPPER l一800．648一1151)。

    (二)Porcoll梯度离心法准备精子

    常规ICSI的精子准备工作在临床卵母细胞收集后进行。作ICSI治疗病人的精液一般都要经过Porcoll(Enhace，IRVINE SCIETIFIc)梯度离心法收集精子。取4支1．5ml离心管，管上写清楚病人的姓名(以下同此要求)，分别加入90％Porcoll和Hepes．。bufferedHTF培养液，配置方法如下表(表24-1)。

    第二、三、四管中的Porcoll和Hepes．buffered HTF混均后顺序贴离心管壁缓慢加入第一管，形成梯度分层。病人多、时间紧的情况下，也可简化为只要90％和50％的两个梯度分层离心管(效果影响不大)。梯度分层离心管制备好后不要放置时间太久使用，以免梯度界面不清。

    刚取出的精液等待液化后，加约为精液量三分之二的Hepes．buffered HTF培养液稀释，混均匀，300×g离心10分钟，去上清。沉淀加1 m1．Hepes．buffered HTF’混均匀，缓慢加入到准备好的．Poreoll梯度分层离心管中，300×g离心30分钟。{(请记住我们的网址(WWW.８５５５２２２.com)(WWW.９１zn.cn)}这时大部分精子被离心到管底和90％Porcoll层中，将沉淀和90％Porcoll层吸出移到另一支15ml离心管中(如沉淀多不用吸90％Porcoll层部分)，加3ml Hepes．buffered HTF，混均匀，300×g离心5分钟，去上清以去除Porcoll(Porcoll影响精子受精)。沉淀加已37℃预热的含10％SSS的HTF培养液0．2～0．5 Tnl(所加的培养液量视沉淀多少而定)，混均匀，300×g离心1分钟以内，放置室温使精子上游待用。

    (三)准备卵子

    将透明质酸酶溶于事先预热在培养箱中的HTlF培养液中(透明质酸酶配成浓度100IU／m1)，用0．22Um的注射器过滤器过滤后放2ml到Organ皿中，带有卵丘和放射冠细胞的卵母细胞吸至此Organ皿中，用巴斯德管在解剖显微镜下吹打。不易脱去的大块卵丘细胞团可用两个细金属针头压向培养皿底撕去，看其卵丘细胞大部分脱去后移置准备好的另一新的清洗皿中。在透明质酸酶中作用的时间大约一分钟，时间一长将影响其后的发育。在新的培养皿中，先后改用150Um和120／~m两种口径的细针管去除剩余的卵丘细胞和连在透明带上的放射冠细胞。玻璃细管的直径不可小于卵细胞直径，以免卵子在针管中挤成椭圆形将损伤其内部结构。得到的裸卵移至Organ皿外槽中最后清洗一次透明质酸酶后放入培养皿中的小滴培养液中，在显微镜下区分细胞减数分裂中期——Ⅱ，可见第一极体的成熟卵母细胞(MⅡ)；未成熟的卵母细胞包括细胞分裂中期——I(M I)和胚泡(germinal vesicle)。只有MⅡ成熟的卵母细胞能做：ICSI，M工和胚泡需要体外培养成熟到MⅡ才能受精。

    (四)显微注射

    1．显微注射系统显微注射系统最主要的仪器包括倒置显微镜和置于它两侧的显微操作仪。倒置显微镜的光学系统应具有三维立体视觉，对精子形态观察可以细致入微，辨别优劣。载物台配置37℃恒温垫板，以保证注射时卵子的温度恒定。操作仪的持卵侧容易控制，持卵针可自己拉制。持卵针的前端要平滑，内径要小，以免吸进卵细胞质。持卵针外径要比卵的直径略小为宜。

    操作仪的注射侧有两个关键性问题要注意：第一，注射侧的整个压力传导系统一定要密闭，且操作要灵敏。传导系统的塑料管内充填的无论是油质还是水质材料以不产生气泡为佳。一旦有气泡产生，说明压力传导系统有漏气，定将导致精子的吸入和推出不能控制自如，注射过程不能顺利完成。注射系统的塑料管是透明的，有气泡能及时发现。固定注射针的固定器有金属和有机玻璃两种，有机玻璃的固定器是透明的，如有气泡产生易于发现而及时排除(美国Sutter-Instrument Company，CA)。但使用何种操作系统，要根据操作者的习惯来选择。第二个关键性问题是注射针的质量，注射针口径的大小和注射针尖的锐利程度关系到精子注入的成败，一旦发现针的质量有问题，不可勉强凑合使用，应及时更换。注射针可自己制作，但注射针自己制作很费时间且需要多种制针设备，使用注射针不多的生殖中心可向公司直接订购(如Humagan Fertility Diagnostics，INC．1-800-937-3210。FAX：804．．295．5912 IJSA)。

    2．精子制动与注射持卵针和注射针分别安装到固定器上，持卵针和注射针要调至一个平面水平，左右呈一条直线。注射针的前端要与皿底平行。

    将准备好的上游精子用拉制好的细玻璃管吸几个微升至培养皿中的PvP滴中，在20倍物镜下寻找形态正常、游动的精子，用注射针的前端贴培养皿底压住精子尾部中段，注射针对尾部施压摩擦至擦破尾部的质膜，然后先尾部后头部将精子缓慢吸入注射针前端。精子制动目的不仅使注射针易于控制精子的吸人，另一目的是从尾部擦破点释放出的精子细胞质和卵子的激活有关。

    准确无误地将质量好的精子吸入注射针前端，并能控制精子在前端移动速度至关重要，控制精子的移动要达到从PVP滴移到培养液小滴的过程中不丢失精子。如果能在注射针中一次转移三个精子，且各精子之间保持一定距离，就可以加快注射速度和缩短卵子在培养箱外的时间。卵子在培养箱外的时间不宜超过30分钟，最好每组卵注射时间在15分钟内完成，并及时将已注射的卵放回培养箱中。卵子放人注射皿的时间和方式根据操作者自己来定，只是要注意对卵子的保护问题。笔者的体会是，最好是注射针从PVP滴吸好精子转移至培养滴后，以嘴吸控制的方式将卵子移进位于显微镜载物台上的注射皿中，以防从载物台移开注射皿，造成注射针多次暴露在空气中易引起注射针的堵塞或污染。

    在低倍镜下将吸有精子的注射针以移动注射皿的方式进入放有卵子的培养滴，持卵针降下到皿底的培养液滴吸住卵子，将第二极体定位在7点的位置。从理论上讲，纺锤丝在第二极体下方，但实际上极体可能错位，如果能在偏振光显微镜头的监察下避开纺锤丝注射更为理想。好的持卵针能稳固地吸牢卵子，卵子可接触皿底，也可悬空，两种位置都不影响注射。完成上述工作，镜头换成高倍镜，清楚聚焦3点钟位置的透明带和注射针尖。缓慢将精子推向针尖并快速刺入卵细胞内。卵的质膜具有高度韧性和弹性，往往针尖已深达9点的位置卵膜仍然不破。质膜已破的标准是回吸精子时卵细胞质无阻碍顺畅地流进针管，此时即可向卵细胞质内注射精子，如质膜未破则将针退回到透明带3点处换方向再行穿刺，直到将质膜刺穿精子被注射进卵子细胞质内，随后才可能发生受精过程。质膜不破，精子留在注射过程形成的质膜凹陷内，卵子不能受精。

    精子注射5至6小时后，可形成雌性和雄性原核。在临床的IVF中心，一般注射后第二天清晨检查受精情况。平均ICSI受精成功率应在80％以上，其中一个雌性原核一个雄性原核的2PN受精卵占总受精的90％左右；两个雌性原核(第二极体、未排卵)一个雄性原核的3PN受精卵时有发生，约占5％一10％，个别情况可达30％；l PN发生的情况约占5％。注射后第二天晨观察到的受精卵的两个原核应已经靠近，如果离的较远预示发育不良。

    在一些少见的病例，活动精子缺如，但精子数量和形态看上去属正常范围。这种情况下，先经eosin-y染色确定有活精子存在后，再确定做ICSI。如有活精子存在，对这部分病人做．ICSI手术时可使用低渗(hypo．osmoic)膨胀法挑选活精子注射，也可直接挑选形态好的精子注射，能达60％的受精率。

   三、取附睾和睾丸精子作ICSI

    当精液中几乎观察不到精子时，则必须考虑从附睾或睾丸取精子。手术是由泌尿外科医生在收集卵母细胞前进行(当天上午)。这种手术现多采用经皮附睾穿刺抽吸术(percutaneous epididymal aspiration，PESA)，PESA只需要在局部麻醉下将针头经皮刺入附睾组织吸取精子，第一次吸出大约200ttl液体，立即滴入Organ皿中，在显微镜下检查有无精子。确定有足够精子注射后，根据精子浓度加入一定量的培养液，上覆盖矿物油放入培养箱中待用。原精液不可过度稀释，应在5×106广ml以上，如第一次抽取液中精子太少，可再抽吸第二次。如果吸出物中无精子，应及时改为从睾丸取活组织检查。

    活检块如黄豆粒大小，立即放入培养液中洗去血细胞，然后移到新鲜的培养液皿中，用消毒过的二把小镊子(修理钟表用的，很小)在解剖镜下撕开部分曲细精管，在显微镜下查看有无精子，只要看到精子立即通知泌尿外科手术医生结束活检手术，缝合创面。继续处理活检组织，在解剖镜下用镊子去除无用的组织，然后将曲细精管分开，拉直。用一把镊子固定曲细精管，另一把镊子的尖端夹住曲细精管往下挤压出曲细精管中的内容物，抛弃空了的曲细精管壁，用玻璃细管吹打分散挤出物，放培养箱中培养待用。

    也有一些IVF实验室采用胶原酶消化曲细精管来获取其中的精子，用溶解红细胞的化学试剂去除红细胞，但睾丸活检组织经过这些化学试剂处理后一定要清洗干净所获取的精子，因为这些化学试剂对受精会有影响。笔者体会，从活检组织中得到的精子数量很少，经离心清洗后会丢失很多精子，回收难度大；而用镊子机械地分离出精子不需要清洗，不容易丢失，此外对精子生物学特性也少有负面影响。

    从附睾和睾丸得到的精子或含有精子的组织不可直接放入PVP中，要使用活检ICSI注射皿(图24-1)。活检ICSI注射皿中央是50ral PVP滴，PVP上端做一个长方形的培养液滴(大小1cm×1．5cm)。下端是50Ul的培养液注射滴。从附睾和睾丸来的精子或含有精子的组织用细玻璃管均匀播撒在长方形的液滴中。用小号金属针头在PvP滴的中央轻轻划痕作为下一步骤放精子和寻找精子的标记。在注射侧的固定器上装一个口径15—20Um的玻璃针管，用此针在长方形液滴中寻找吸取精子并移人PvP滴的划痕标记处。收集到的精子数和卵子数等同后，开始按常规ICSI步骤注射精子。

    做完附睾或睾丸精子注射后，剩余的精子最好冷冻保存以便下次使用，尽量减少从病人附睾和睾丸取材的次数。