生殖感染检测
生殖系统感染是引起不孕不育症的重要原因，近年来随着性传播疾病发病率的上升，由生殖道感染引发的不孕不育者日趋增多，人们逐步认识道这些高危病原体不仅引起泌尿生殖到感染和垂直传播，对人类健康可造成极大的危害。同时这些病原体对男性精子有较强的粘附性，可随镜子进入生殖道，并导致上生殖道炎症；对女性感染后可造成输卵管阻塞。通过引起生殖道慢性炎症，造成泌尿生殖道的不可逆病理改变，可干扰男性精子的活动力和活动率，阻塞女性输卵管，更为严重的是破环机体的免疫系统产生相关抗体，造成不孕不育症。目前研究调查发现，由生殖感染引起的不孕不育的病原主要为淋球菌、支原体和衣原体，认为是引起生殖感染造成不孕不育症的三大病原。除此之外，还有病毒，如HSV-2、EBV、HCMV、腮腺炎病毒等，阴道滴虫，念珠菌等。其实验室诊断，以从传统的分离培养，免疫学方法发展至分子生物学方法，为生殖感染的诊断提供更加快速、准确的依据。
（一）方法学应用
1、分离培养法：分离培养是病原微生物确诊的金指标，特异性高，但敏感性低，培养要求高，时间长，培养结果阴性并不能说明不存在感染，一旦培养阳性即可确诊。
2、免疫学方法：包括直接免疫荧光法、酶联免疫检测法及胶体金法，其试验原理为抗原抗体反应，与分离培养相比，具有快速、简便、敏感的特点，但均存在一定的非特异性反应。
3、分子生物学方法：包括核酸分子杂交技术、PCR技术、基因芯片技术等。
（1）分子杂交技术原理：在生理条件下，DNA呈稳定的双链螺旋结构。DNA分子中双链核酸的结合是依靠互补碱基对之间的氢键结合力，这种结合是可逆性的（非共价结合），并且是序列特异性的（碱基互补配对）。在体外，当有变性因素存在时（如温度超过65℃，含甲酰胺或极端pH时），DNA分子内部的氢键断裂，解离成两条无规则的卷曲状的单链DNA，此现象称为变性。除去变性因素后，单链DNA能通过碱基互补再结合成稳定的双链螺旋结构，此过程称为复性或退火（anneal）。在复性过程中，若存有与样品核酸某部分序列相同或高度同源的外源性单链DNA片段或寡核苷酸时，则二者的互补碱基间可产生氢键，形成杂交体，即双链DNA分子。此过程称DNA杂交反应（hybridization reaction）。杂交反应不仅发生在DNA与DNA之间，也可发生在DNA与RNA、RNA与RNA之间。生成的杂交体分别为DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA的双链结构。外源性序列相同或高度同源的DNA（RNA）片段或人工合成的寡核苷酸（一般为15～45个碱基），标记上放射性同位素或非放射性标记物，通过杂交反应去探测未知样品中是否存在互补序列，这种标记的核酸片段或寡核苷酸称为探针（probe）。此技术是感染性疾病应用最早的分子生物学技术之一。具有特异、敏感、准确的特点，可从基因水平揭示病原体的感染程度。但由于操作步骤复杂，在临床应用中受到一定的限制。
（2）PCR反应原理：PCR是体外酶促合成特异 DNA片段的新方法，主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成：即在高温（95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～55℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq DNA聚合酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的指数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。将扩增产物进行电泳，经溴化乙锭染色，在紫外灯（254nm）照射下一般都可见到DNA的特异扩增区带。其特点为：特异性强、敏感性高、快速、简便等，此技术在80年代末到90年代中期在病原体的快速诊断，特别是在性传播疾病的快速诊断中得到了广泛的应用。
荧光定量PCR比常规PCR多一个寡聚核苷酸探针（Taq Man探针），该探针带有一个荧光发光分子和一个荧光淬灭分子，完整的探针在激光激发下，发光分子所产生的荧光被淬灭分子全部吸收，样品无荧光。而PCR扩增过程中，Taq酶分子在链延长过程中可以通过自身的5’→3’核酸外切酶降解与模板结合的特异性荧光探针，使得荧光发光分子从探针上切下来而与荧光淬灭分子分开，从而在激光激发下产生特定波长的荧光，这种荧光随着PCR扩增过程而动态增强，通过定量PCR仪全过程实时动态监测，可以得到每一样品实际扩增曲线，找出PCR扩增的对数期，再通过标准样品和待测样品的对数期比较，很容易得到每一样品中特定模板DNA的启始拷贝数。荧光定量PCR的出现为PCR技术的发展提高到一个新的发展应用水平，定量PCR可以分析某一基因的转录水平，也可以对特异病原体DNA或RNA进行定量研究，以判断感染的严重程度及药物治疗的疗效。
（3）基因芯片原理：基因芯片又称生物芯片，就是利用芯片制造技术，将分子生物学技术微量固化在有限空间的基片上，以达到快速高效的使用分子生物学技术的目的，是九十年代发展起来的，横跨生命、信息、物理等领域，涉及生命科学、微电子技术、计算机科学等多学科的高新技术产物，是当今世界最前沿的热点。其原理：在芯片的基片上利用微点阵技术产生不同的DNA探针阵列，所谓“探针”，是指人工合成或筛选出的已知顺序的碱基序列。在基因芯片工作过程中，在固定位点使用不同分子生物学技术和碱基互补配对原则与待测基因片段杂交并通过自动阅读设备分析杂交结果，达到定性，定量分析。如果应用适当的技术还能进行结构分析，如对不同的碱基标记不同的荧光于PCR体系，扩增产物与芯片探针杂交，可直接读出碱基序列。并且同一基因芯片可以同时集成不同的分子生物学技术如PCR，酶切等，以达到同一块芯片能同时检测分析多种基因的目的。特点：高速度、高容量、低成本、便利操作。（由于基因芯片能同时检测多种基因，大大提高了工作效率，同时是微量测定也降低了成本）。基因芯片技术是目前分子生物学技术中最为先进的方法，由于具有高通量的筛选能力，在病原微生物的检测诊断中，可在一张芯片上检测出多种病原体，具有广阔的应用前景。
（二）生殖感染检测的意义
1、淋球菌（NG）
淋球菌是淋病的病原，是最早的性病之一。是泌尿生殖道炎症中最常见的病原体，可引起泌尿生殖道和围产期的多种感染性疾病，对人类健康造成极大的危害，同时对精子具有较强的粘附性，破环和干扰精子及卵子的正常活动，所以，认为淋球菌感染可造成不孕不育已被所公认。其实验室诊断极为重要：
（1）分离培养法：是世界卫生组织推荐的确诊淋病的唯一标准方法，只要培养结果阳性即可确诊，是诊断淋病的重要证据。其阳性率可达到：男性80-95%，女性80-90%。
（2）免疫学方法：免疫学方法作为淋病诊断的非培养技术，对淋病的慢性携带者及无症状者，具有一定的应用价值。酶联免疫法用于检测标本中的淋球菌抗原，作为辅助诊断。免疫荧光法用于淋球菌的诊断可在暗背景下查找发荧光、具有典型的形态特征的荧光亮点，具有抗原抗体反应的特性，又有形态学的特征，是一种诊断淋病非培养技术较好的方法。
（3）聚合酶链反应(PCR)：是采用分子生物学技术而建立的一种新的检测方法，具有敏感度高，特异性强，而且检测速度较快的优点。PCR的灵敏性和特异性：由于CPPB在不含有隐蔽质粒的淋球菌染色体上也会含有CPPB基因，再加96%的淋球菌都会有隐蔽质粒，因此用CPPB作为靶序列的引物具有极高的敏灵性，实验证明，一般传统一步PCR（GC1-GC2）方法可以检出3个淋球菌，而用单管巢式PCR（GC2-GC4）可以检出≤0.3淋球菌（9个CPPB基因）。这些引物经特异性实验，只能扩增淋球菌的DNA，而对非淋球菌奈瑟氏菌扩增不出特异产物。用聚合酶链式反应（PCR）、基因探针、连接酶链式反应（LCR）等特殊方法,在DNA分子水平上检测淋球菌的特异性基因片段。此类方法敏感性高、特异性强，可用于慢性、轻症、治疗后复查的患者，但需高精度设备，特殊试验条件，费用较高，对操作人员素质要求较高。检查方法不能区分淋球菌是否存活，患者在治愈后的一段时间内，仍会有死亡的淋球菌排除，基因诊断检查法会持续阳性，所以对于治疗后复查的患者，应在治疗３周后复查。其临床意义：有利于早期诊断；有利于无症状诊断；有利于病程跟踪，指导临床治疗；用荧光PCR相对于传统的PCR方法由于去除了后处理的过程，大大减低了假阳性。
2、沙眼衣原体感染（CT）
衣原体感染会造成女性不孕，这已经是医学共识。瑞典科学家的一项新研究则表明，衣原体还会直接导致男性不育。衣原体感染会使女性输卵管阻塞或受伤，造成输卵管性不孕。在性活动活跃的年轻人中，衣原体感染很常见，这是生育健康的一大问题。沙眼会引起男性不育的研究结论会让你大吃一惊。事实上，由于沙眼衣原体的感染，会引起男性尿道炎、输精管炎和附睾炎以及性功能障碍。更由于输精管炎症而使精子活动能力减弱，进而引起不育。
（1）分离培养：衣原体的分离可用于细胞培养、鸡胚培养和动物接种三种方法进行，所有衣原体均可在细胞培养和鸡胚卵黄囊中生长。虽然分离培养为诊断CT的金指标，但由于CT培养要求条件极高，在临床诊断难于开展，所以在CT的实验室诊断中一般均采用非培养技术。
（2）免疫荧光技术：用直接法荧光抗体染色检测上皮细胞内的典型衣原体包涵体，用荧光素标记的抗衣原体LPS单克隆抗体，可与衣原体相应抗原结合反应。其敏感性在高危人群中可达88-99%；在中等感染人群中可达61-96%，特异性在高、低人群中分别为：95%和87%。在不孕不育者中，男性35.9%;女性38%，此方法常与培养法结合，作为评价CT感染的诊断标准。
（3）PCR技术：目前已知沙眼衣原体有15个血清型，所以选择沙眼衣原体特异性引物应为染色体基因组中的外膜蛋白序列，可用于沙眼衣原体15个血清型的基因诊断。用质粒DNA为靶基因，有症状的男性尿道试子或尿标本，其敏感性90％。PCP技术用于沙眼衣原体的诊断以来，在控制衣原体感染中，是一项很有效的广谱的筛选试验，其敏感性为90－95％，特异性为99.5％。所以，可用于大规模无症状人群的筛选检查。
（4）非培养法在检测CT应用中的评价：由于培养法分离衣原体需要一定的设备和技术，而且繁琐费时，非培养法检测具有一定的优越性和应用价值。其检出结果快，一般可在30min到4h可完成，可用于大批量的筛选。虽然免疫荧光和酶联免疫能广泛应用于临床标本的检测，但免疫荧光易出现非特异性荧光，判断结果的主观性，荧光易于淬灭等不足，所以在应用时应加于控制。酶联免疫法可用于大批量标本检测而不适宜少量标本试验，而且其敏感性和特异性及可重复性也不十分理想。分子杂交检测，操作繁琐费时，又有放射性，限制了作为常规应用。PCR技术具有高特异性和高敏感性，但由于标本处理不当或试验控制问题，易出现假阳性结果，在实验过程中必须设标准对照，以保证结果的准确性。
3、支原体感染（UU）
支原体是一类原核细胞微生物，体积介于细菌与病毒之间，对人类致病的支原体有３种，其中解脲支原体是人类泌尿生殖道的常见病原体，与许多泌尿生殖道感染症、围产期感染和不育症等都有关系，是性传播疾病的病原体之一。是导致男性不育很常见的因素之一。支原体经尿道感染后患者可出现尿道炎症状，并可继发慢性前列腺炎。在检查前列腺液时，可见活泼、泳动的微生物群体。支原体还继续感染精道、精囊和睾丸，影响精子和精液的质量，引起不育。支原体干扰精子运动：精子运动是健康精子的一项重要功能，支原体感染精子后，常常附着在精子的头部和尾部，使整个精子挂满了大小不等的附着物，致使精子泳动无力，互相缠绕，导致不育；支原体使精子畸形率增加：支原体感染导致精子畸形率增加是造成不育的另一特征。据临床观察，在这类不育患者中,精子畸形率有时可高达80%；支原体破坏生精细胞：睾丸的曲细精管中有大量生精细胞，这些生精细胞经过发育繁殖形成精子。当支原体从尿道、前列腺等部位进入睾丸曲细精管后，会破坏生精细胞，使“生精工厂”产生伪劣产品，导致不育。
（1）分离培养法：支原体的培养可分为：普通培养法和快速培养法，普通培养是将待检标本接种于U9B液体培养基中，在5%CO2环境中培养1-2天后，在显微镜下观察支原体生长形态，如由典型煎蛋状菌落即可为阳性培养结果。由于培养法技术要求苛刻，培养困难，费时繁锁，不利于常规应用。支原体的快速培养是目前各实验室应用较为普遍的支原体检测方法，它是利用支原体分解尿素酶的特性，根据培养基中指示剂的颜色变化，确定支原体的生长情况。
（2）免疫学方法：一般采用的是免疫荧光法和胶体金标记法，酶联免疫法一般不用于支原体的检测。免疫荧光法是将待检标本经固定后，加支原体荧光抗体，经结合反应后，用PBS冲洗，甘油缓冲液封片，荧光显微镜下观察，在荧光显微镜下见道亮绿色、具有典型大小、边缘清晰的圆形颗粒，可报告为支原体荧光抗体阳性。胶体金标记法，是将支原体抗体经胶体金标记后，固定于硝酸纤维膜上，然后将待检标本滴加于模上，经数分钟反应，即可呈显红色条带或斑点，即为支原体阳性。
（3）PCR技术：PCR法检测支原体随着引物选择的不同，扩增出的特异性片段长度不同，灵敏度和特异性也有差异。现已证实，PCR技术在检测支原体的临床应用中表现出特异性强，操作简便，省时等特点，灵敏度不亚于培养法，是目前认为检测支原体的临床快速诊断的方法。
（三）基因芯片技术在生殖感染病原体诊断中的应用
基因芯片技术是将多病原体的特异性探针有机的固定在一张微芯片上，当与相对应的病原体结合后，经过杂交、显色等步骤，即可将阳性结果显示在芯片阅读仪上，再经过生物信息处理，得出结果。目前我国已开发出多病源体的检测芯片，用于生殖感染的多病原体（NG、CT、UU等）检测芯片也已研制成功，并逐步向临床应用过度。基因芯片应用于生殖感染的的诊断，将在优生优育及不孕不育症的诊断中发挥积极地作用。
